Cinetica enzimatica

Energia libera delle reazioni

Affinché una reazione chimica possa avvenire è necessario che i reagenti:

• siano nel giusto orientamento;
• vengano a contatto; acquistino l’energia necessaria per rompere i vecchi legami chimici e formarne di nuovi.

Tutte le reazioni metaboliche che avvengono nelle cellule sono caratterizzate da una determinata energia: l’energia libera (G), ossia l’energia necessaria per produrre lavoro durante la reazione stessa.

La variazione di energia libera (ΔG) è la differenza tra l’energia dei prodotti e quella dei reagenti.

Il ΔG di una reazione dipende principalmente dalla natura e dalla concentrazione dei singoli reagenti, e dalla temperatura. Il valore del ΔG fornisce informazioni sulla spontaneità della reazione:

• Se il valore del ΔG è negativo (ΔG < 0) la reazione è spontanea, e procede con rilascio di energia e viene detta esoergonica;
• Se il valore del ΔG è positivo (ΔG > 0) la reazione non è spontanea, e per procedere con consumo di energia e viene detta endoergonica.

ENZIMI E CATALISI

Di tutte le funzioni che svolgono le proteine la più importante è sicuramente la catalisi per cui sono detti catalizzatori biologici. Ad eccezione di alcuni enzimi a RNA detti ribozimi, tutti gli enzimi sono proteine. Gli enzimi sono altamente specifici per i loro reagenti (detti substrati) al punto che riescono a distinguere anche uno stereoisomero dall’altro. La velocità di una reazione e il suo essere termodinamicamente favorita sono 2 aspetti diversi, ma strettamente correlati tra loro. L’energia di attivazione è la quantità di energia richiesta per far avvenire la reazione, ossia per portare i reagenti nello stato di transizione (corrispondente al picco della curva nel grafico) e poi trasformarli in prodotti. L’energia di attivazione, pertanto, rappresenta la barriera energetica che separa i reagenti dai prodotti. La velocità di una reazione dipende dall’energia di attivazione: minore è l’energia di attivazione maggiore sarà la velocità della reazione La presenza di un catalizzatore aumenta notevolmente la velocità con cui avverrà la reazione perché gli enzimi abbassano l’energia di attivazione.

In una reazione enzimatica, l’enzima si lega al substrato tramite interazioni deboli (legami ionici, legami idrogeno, interazioni idrofobiche, forze di van der Waals) altamente specifiche tra il substrato S e una porzione dell’enzima, detta sito attivo, che solitamente è una tasca proteica, formata da aminoacidi essenziali per l’attività enzimatica.  Si forma così il complesso enzima-substrato ES, che porta alla formazione di uno stato di transizione e poi porterà alla formazione del prodotto. Per spiegare il meccanismo di legame del complesso enzima-substrato sono stati e immaginati più modelli (es. chiave-serratura), ma oggi quello universalmente accettato è il modello dell’adattamento indotto che tiene conto del fatto che le proteine hanno una certa flessibilità conformazionale. Secondo questo modello, il legame del substrato induce un cambio conformazionale nell’enzima che porta ad un adattamento complementare del sito attivo e che permette alla catalisi di avvenire: i legami vengono riorganizzati. Nel sito attivo, il substrato si trova vicino agli atomi con i quali deve interagire ed è posizionato in modo da trovarsi nel corretto orientamento rispetto ad essi, per cui i vecchi legami vengono rotti e vengono formati nuovi legami, e il substrato si trasforma in prodotto, che viene rilasciato dall’enzima. L’enzima a sua volta ritorna nella conformazione originaria e può tornare a catalizzare ulteriori reazioni su altre molecole (Ciclo catalitico).

Classificazione degli enzimi

Gli enzimi sono classificati in base al tipo di reazione che catalizzano in sei classi funzionali, ognuna suddivisa in molteplici sottoclassi. Nella denominazione specifica dell’enzima di solito è riportato il nome del substrato ed il tipo di reazione catalizzata con l’aggiunta del suffisso “asi”.

COENZIMI E COFATTORI

I cofattori sono sostanze inorganiche che partecipano attivamente alla reazione enzimatica.

I coenzimi sono molecole organiche dalla struttura spesso molto complessa: una vitamina o un suo derivato.

Alcuni coenzimi contengono nella loro struttura anche una componente nucleotidica es: Nicotinammide adenina dinucleotide (NAD+); Flavina adenina dinucleotide (FAD); Coenzima A.

Nelle reazioni biologiche di ossido-riduzione gli elettroni sono rimossi da specifici enzimi, le deidrogenasi, sorrette da specifici coenzimi: NAD+, NADP, FAD.

NAD+ e NADP

Il nicotinammide adenina dinucleotide (NAD) e il suo analogo nicotinammide adenina di nucleotide fosfato (NADP) fungono da coenzimi di molte deidrogenasi. Nelle molecole di NAD e NADP è presente la niacina (vitamina B3).

I coenzimi nella forma ossidata (NAD+ e NADP) accettano 2 elettroni e 1 protone ciascuno e si trasformano nella loro forma ridotta (rispettivamente NADH e NADPH). L’altro protone (H+) rimosso al substrato viene rilasciato nel solvente acquoso:

NAD+ + 2 e- + 2 H+ → NADH + H+

NADP + 2 e- + 2 H+ → NADPH + H+

Il NAD+ è impegnato nelle redox cataboliche. Il NADP è impegnato nelle redox anaboliche.

FAD

Il flavin adenina dinucleotide (FAD) è un altro coenzima di altre deidrogenasi. Nella molecola dei coenzimi FAD è presente la riboflavina (vitamina B2).

Il coenzima nella forma ossidata (FAD) accetta 2 protoni e 2 elettroni, trasformandosi nella forma ridotta (FADH2):

FAD + 2 e- + 2 H+ → FADH2

Regolazione e controllo dell’attività enzimatica

In una cellula le varie vie metaboliche devono funzionare in maniera coordinata per rispondere alle diverse esigenze della cellula: gruppi di enzimi lavorano insieme per produrre una via metabolica in cui il prodotto del primo enzima diventa il substrato del secondo e così via. L’enzima che catalizza la reazione più lenta determina la velocità complessiva ed è un ENZIMA REGOLATORE (nella maggior parte dei casi è quello che catalizza la prima reazione) la cui attività catalitica è regolata mediante:

• INIBIZIONE: Una sostanza che interferisce con l’azione di un enzima e rallenta la velocità di una reazione viene detta INIBITORE. Gli inibitori possono influenzare una reazione enzimatica in 2 modi:

• Un inibitore irreversibile reagisce con l’enzima, legandosi ad esso con un legame covalente e modificandolo fino a renderlo enzimaticamente inattivo, per cui l’enzima originale non potrà più essere rigenerato;
• Un inibitore reversibile può legarsi all’enzima tramite legami non covalenti e poi essere rilasciato, permettendo quindi all’enzima di ritornare alla sua condizione originaria (es. INIBIZIONE retroattiva o A FEEDBACK: il prodotto finale di una sequenza di reazioni inibisce la 1ª reazione della via metabolica). Gli inibitori reversibili possono a loro volta essere suddivisi in 2 classi differenti in base ai siti ai quali si legano sull’enzima:

• INIBIZIONE COMPETITIVA: l’inibitore è un composto molto simile strutturalmente al substrato, per cui compete col substrato per legarsi al sito attivo e, quindi, se si lega al sito attivo, impedisce l’accesso al substrato. Dato che substrato e inibitore competono per lo stesso sito attivo, un substrato ad elevata concentrazione spiazzerà l’inibitore;
• INIBIZIONE NON COMPETITIVA: l’inibitore si lega a un sito diverso dal sito attivo (detto sito regolatore) e, in conseguenza del legame, si ha un cambiamento della struttura dell’enzima che modifica la struttura dell’enzima nelle vicinanze del sito attivo, per cui se l’inibitore è legato al sito regolatore l’enzima non riesce a catalizzare la reazione, anche se il substrato si lega al sito attivo.

• Modificazione covalente reversibile: aggiunta o rimozione di gruppi chimici su specifici residui amminoacidici dell’enzima, ad esempio FOSFORILAZIONE di Aminoacidi (trasferimento di un gruppo fosfato dall’ATP all’enzima) ad opera di chinasi, che permette ad es. la conversione da enzima attivo in inattivo, oppure DEFOSFORILAZIONE ad opera di fosfatasi;
• Modificazioni covalenti irreversibili: gli enzimi digestivi (pepsina, tripsina, chimotripsina) vengono secreti in forma inattiva (zimogeni: pepsinogeno, tripsinogeno e chimotripsinogeno) e la conversione nella proteina matura richiede uno o più tagli proteolitici che determinano modificazioni conformazionali che favoriscono la formazione del sito attivo;
• ALLOSTERIA: in ogni via metabolica una o più reazioni sono catalizzate da enzimi allosterici: tali enzimi hanno una struttura quaternaria, in quanto sono costituiti da più subunità polipeptidiche, ed è possibile distinguere:

• un sito catalitico al quale si lega il substrato;
• un sito regolatore (detto sito allosterico) al quale si lega una molecola che funge da modulatore (detta effettore allosterico) positivo o negativo.

CINETICA DEGLI ENZIMI ALLOSTERICI E NON ALLOSTERICI

La cinetica enzimatica studia la velocità delle reazioni catalizzate da enzimi in funzione di: concentrazione del substrato; temperatura; pH; presenza di inibitori o attivatori.

Negli enzimi allosterici le subunità catalitiche esistono in due forme conformazionali interconvertibili tra loro:

1. una (TESA) a bassa affinità per il substrato e a minore attività catalitica;
2. l’altra (RILASSATA) ad alta affinità per il substrato e a maggiore attività catalitica.

Il legame del substrato e/o dei modulatori determina il cambio conformazionale verso l’una o l’altra conformazione.

Se si riporta in grafico la velocità della reazione in funzione della concentrazione del substrato si ottiene una curva sigmoidale, perché gli enzimi allosterici presentano un comportamento cooperativo tra le diverse subunità: le modificazioni strutturali (cambio conformazionale) di una subunità vengono trasmesse alle altre subunità. Piccole variazioni di concentrazione del substrato possono determinare notevoli variazioni nell’attività dell’enzima. Idem per emoglobina.  

Invece, per la maggior parte degli enzimi (enzimi non allosterici) si ha una diversa cinetica (detta Cinetica di Michaelis-Menten): all'aumentare della concentrazione del substrato, la velocità della reazione aumenta fino al raggiungimento di un massimo in cui tutto l’enzima è saturato col substrato, descrivendo quindi un’iperbole. Idem per mioglobina.

Metabolismo

Il metabolismo è l’insieme di tutte le reazioni chimiche che avvengono in una cellula o in un organismo.

Il metabolismo si divide in:

• catabolismo = degradazione di molecole complesse in molecole più semplici con produzione di energia
• anabolismo = sintesi di molecole complesse a partire da molecole più semplici con consumo di energia.

Nel catabolismo le molecole delle sostanze nutrienti, come carboidrati, grassi e proteine, sono trasformate in prodotti più semplici (CO2, H2O, NH3) attraverso un processo ossidativo che produce energia chimica sotto forma di molecole di ATP e di trasportatori di elettroni in forma ridotta (NADH, NADPH e FADH2).

Nell’anabolismo i precursori semplici, come glucosio, acidi grassi, amminoacidi e nucleotidi vengono sintetizzati e poi utilizzati per la sintesi di macromolecole complesse (polisaccaridi, lipidi, proteine, acidi nucleici), grazie a un processo riduttivo che richiede l’energia chimica delle molecole di ATP e il potere riducente di NADH, NADPH e FADH2.

Una via metabolica è una sequenza di reazioni chimiche che portano alla trasformazione di un substrato in un prodotto. Le singole tappe di una via metabolica sono reazioni catalizzate da enzimi specifici, nelle quali il prodotto di una reazione è il substrato della reazione successiva.

Le vie metaboliche possono essere:

cataboliche;

anaboliche;

anfiboliche = sia catabolica sia anabolica.

Regolazione delle vie metaboliche

Le vie metaboliche sono regolate ed in ogni via metabolica c’è almeno una reazione regolata, catalizzata da un enzima regolatore.

La via catabolica e quella anabolica relative ad uno stesso composto, come ad esempio glicolisi e gluconeogenesi sono regolate in maniera coordinata: infatti, sono collegate tra loro e spesso hanno intermedi in comune. Quando una via è attiva, l’altra risulta bloccata.